污泥作為污水處理的末端產物，其總量不斷增加，如果隨意排放會對環境造成嚴重污染，因此，采用合理的方法解決污泥問題成為當下研究的重點。衛生填埋法和焚燒法均對環境有一定的危害，而厭氧消化作為一種環境友好型污泥處理手段，其中間產物揮發性脂肪酸（VFAs）是一種高附加值的小分子有機碳物質，不僅可以用于污水脫氮除磷，解決污水處理廠碳源不足的問題，還可作為合成生物可降解塑料（PHAs）的原材料，對環境污染小且應用價值高。因此，污泥厭氧發酵產VFAs在污泥資源化處理中應用更為廣泛。

水解過程是污泥厭氧發酵產酸的限速步驟，生物酶法和超聲處理均可以加快污泥水解進程，且整個過程綠色環保，無二次污染。超聲產生的羥基自由基（·OH）和瞬時高溫高壓，可以有效分解污泥中微生物的胞外聚合物（EPS）和細胞壁，已有報道表明超聲在污泥減量中實現了工業化應用，然而高能耗是限制該技術發展的重要因素。生物酶對微生物降解具有高效催化性，Luo等利用淀粉酶和蛋白酶強化剩余污泥的溶胞水解及污泥減量，最佳酶投加量為60mg/gTS，VSS去除率高達39.70%，且復合酶（蛋白酶∶淀粉酶=3∶1）效果優于單一酶，VFAs產量為空白對照組的2.04倍。

生物酶和超聲對污泥處理均有一定優勢，然而關于兩種技術聯用的報道較少。超聲可以實現污泥絮體和微生物的初步解體，然后通過生物酶強化污泥厭氧水解產酸過程，兩種技術聯用在發揮各自優勢的同時能夠降低系統能耗。筆者采用超聲聯合生物酶技術強化剩余污泥有機質水解和產VFAs，并通過高通量測序對厭氧發酵過程中微生物群落的結構變化進行分析，從生物學角度揭示超聲和生物酶聯用技術強化污泥厭氧發酵產酸機理。

1、材料與方法

1.1 實驗材料及設備

實驗所用剩余污泥取自天津市某污水處理廠二沉池，該污水廠采用的是活性污泥法。剩余污泥靜置24h后，棄去表層上清液，于4℃冰箱中保存。污泥性質如下：pH=7.32，TSS=7332mg/L，VSS=4671mg/L，TCOD=6232mg/L，SCOD=89mg/L，TN=12mg/L，TP=0.8mg/L。所用生物酶為纖維素酶、α淀粉酶、溶菌酶和復合酶（纖維素酶∶α-淀粉酶∶溶菌酶=1∶1∶3）。

1.2 實驗方法

實驗控制參數參考文獻，將1800mL剩余污泥投入2000mL燒杯，置于超聲破碎儀處理5min，其中超聲振幅為80％，頻率為20kHz。將處理后的污泥投入厭氧發酵反應器中，生物酶投加量為污泥干質量的2.5％，充入氮氣，機械攪拌速度維持為（90±10）r/min。厭氧發酵反應器置于恒溫水浴鍋中，溫度維持在35℃左右，設置發酵時間為14d，每48h取樣一次，經0.45μm濾膜后測定VFAs，每次實驗做3組平行。發酵結束后，取產酸量最佳的樣品和對照組污泥置于-25℃冰箱中儲存，后續進行微生物群落分析。

1.3 檢測方法

TSS和VSS根據標準方法測定，SCOD、TN和TP等采用哈希試劑法測定，pH采用pH計測定，污泥粒徑采用激光粒度分析儀檢測。

VFAs采用氣相色譜法測定，取樣后經0.45μm濾膜過濾，酸化至pH<4，最后進樣測量，采用氫火焰離子化檢測器和Agilent19091J-413色譜柱（30m×320μm×0.25μm）。色譜條件如下：設置進樣口溫度為260℃，初始柱溫為80℃，進樣體積為0.2μL；檢測器溫度為280℃，分流比為30∶1。最后按照乙酸為1.07、丙酸為1.51、正丁酸和異丁酸為1.82、正戊酸和異戊酸為2.04的換算系數，將溶解性脂肪酸（SCFAs）濃度轉化為COD濃度。

微生物多樣性分析采用Illumina公司的MiSeqPE300/NovaSeqPE250進行測序，使用快速DNASPIN試劑盒提取污泥DNA，采用真/古細菌兼容通用前端引物341F（5'-CCTACGGGRBGCAGCAG-3'）和后端引物806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTA-3'）對細菌16SrRNA基因的V3-V4區進行PCR擴增。

2、結果與討論

2.1 超聲對污泥性能的影響

超聲處理前污泥上清液中SCOD、TN和TP濃度分別為89、12和0.8mg/L，處理后分別為338、104和4.3mg/L，相較于處理前分別增加了279.8％、766.7％和437.5％。原因在于低頻超聲的機械剪切力和空化效應可以充分破壞污泥絮體和微生物細胞，在較短的處理時間內（5min）污泥溶出有機質濃度明顯上升。

處理前污泥的比表面積為0.279m2/g，處理后為0.413m2/g，表明超聲可以有效解體污泥的絮體結構，導致單位質量污泥的表面積增大。超聲處理后污泥的D90（90%顆粒粒徑）由低于470.86μm降至258.90μm以下，同時污泥的D50（平均粒徑）由80.908μm下降至43.362μm，推測超聲破壞了污泥菌膠團結構，導致絲狀菌破裂，由絲狀菌連接的微生物細胞和EPS被分散。因此，超聲預處理可以有效破壞污泥的表觀結構，增大污泥比表面積，降低污泥粒徑，同時促進內溶有機質釋放，為生物酶強化污泥發酵產酸降低傳質阻力。

2.2 生物酶對剩余污泥VSS去除率的影響

VSS去除率可表示顆粒有機物的水解效果，剩余污泥VSS去除率隨發酵時間的變化見圖1。

由圖1可知，與空白對照相比，超聲聯合生物酶對污泥水解有顯著促進作用，其效果排序為：復合酶>溶菌酶>α-淀粉酶>纖維素酶>空白對照，其中復合酶作用下的污泥VSS去除率最高達到44.2％。在整個發酵過程中，VSS去除率在0~2d明顯提高，其中復合酶作用下的VSS去除率增加幅度最大即37％，空白對照增加幅度最小即5.3％。原因是復合酶可以從多個活性點位水解污泥，破壞污泥絮體結構，促進污泥中微生物細胞和EPS降解，有效實現污泥減量。這與Yang等研究結果相似，Yang等發現相較于單一酶，混合酶（蛋白酶∶淀粉酶=1∶3）對污泥的溶解效果更好，在溫度為50℃時，污泥水解效率由10％（對照實驗）提高到68.43％。

2.3 生物酶對剩余污泥VFAs的影響

VFAs由乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸組成，圖2為不同生物酶處理下剩余污泥VFAs隨發酵時間的變化。

由圖2可知，在整個發酵過程中，VFAs濃度先升高后降低，除對照組外，均在第4天達到峰值，VFAs濃度排序為：復合酶>溶菌酶>纖維素酶>α-淀粉酶>空白對照，分別為1209.2、929.4、724.3、641.9和192.6mg/L。其原因在于經超聲聯合生物酶處理后的污泥發酵系統中，污泥絮體破碎，有機質大量溶出，同時產酸菌群在生物酶的催化作用下高效地將有機質轉化為VFAs。在第4天后，VFAs濃度顯著降低，這主要是由于隨著發酵時間的延長，產甲烷菌將VFAs轉化為CO2、甲烷等氣體。

2.4 VFAs組成分析

生物酶污泥處理系統產酸累積量的最大值出現在第4天，因此有必要對第4天VFAs的組成進行分析，結果見圖3。

由圖3可知，在復合酶污泥系統中，乙酸濃度最大即736.3mg/L，遠高于其他酸的濃度，且在所有發酵系統中，復合酶系統所產生的乙酸量最高，說明超聲聯合復合酶處理加快了污泥水解進程，增大了剩余污泥中有機物濃度，促進了丙酸、丁酸和戊酸等向小分子乙酸轉化，使污泥水解更為徹底。乙酸作為污泥發酵過程產生的優質有機碳，可以在發酵液的后續利用中直接用于補充污水處理系統的碳源。

2.5 微生物群落分析

2.5.1 Alpha多樣性指數分析

第4天微生物群落的Alpha多樣性指數分析結果見表1。

由表1可知，第4天空白對照組、溶菌酶系統和復合酶系統的序列數均大于20000；Coverage是反映測序深度的指數，其值均大于0.99，兩者說明所收集的基因序列可以很好地代表污泥中的微生物群落，足以反映樣品的大部分信息。空白對照組的Chao指數高于溶菌酶和復合酶系統，說明空白對照組污泥的微生物豐度更高。Simpson和Shannon指數反映了樣品中微生物的多樣性，溶菌酶和復合酶系統污泥的兩個指數均低于空白對照組，可能是因為超聲聯合生物酶處理過程強化了與水解酸化相關的功能微生物，而關聯度較小的微生物被淘汰，使得生物酶系統表現出相對較低的物種豐度。

2.5.2 操作分類單元（OTUs）韋恩圖分析

微生物群落的OTUs韋恩圖見圖4，其中A1、B1、C1分別代表空白對照組、溶菌酶系統、復合酶系統。

由圖4可知，相較于溶菌酶和復合酶系統，空白對照組的OTUs數分別增加了1047和1042，說明生物酶系統中污泥的微生物豐度較低。空白對照組和復合酶系統的OTUs共享數在空白對照組總數中占比較小，表明污泥中微生物群落隨超聲和生物酶的作用而發生改變，表現出較大差異。復合酶和溶菌酶系統單獨所有的OTUs數分別占總數的27.24％和27.17％，表明超聲聯合復合酶與溶菌酶對污泥的作用效果存在一定差別，不同生物酶使得污泥中微生物的種類和數量發生改變。

2.5.3 門水平物種組成

為進一步闡明聯合處理后污泥的厭氧發酵產酸機理，就復合酶系統（C1）、溶菌酶系統（B1）和空白對照組（A1）進行了門水平上的微生物群落分析，其物種組成見圖5。

由圖5可以看出，在復合酶系統中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）占主導地位，為總序列的93.2％；在溶菌酶系統中，Firmicutes和Proteobacteria占主導地位，為總序列的87.9％；而空白對照組物種分布較為均勻，Proteobacteria占比最高為40.3％，Firmicutes和Bacteroidetes僅占1.5％和4.8％。由此可見，超聲聯合生物酶的作用改變了微生物豐度，提高了Firmicutes和Bacteroidetes的占比。Firmicutes中大部分微生物與碳水化合物的水解和產酸活性相關，能夠將纖維素等復雜碳水化合物降解為乙酸和丁酸等小分子有機物。Bacteroidetes能夠產生纖維素酶、蛋白酶等水解酶，將有機物轉化為CO2、葡萄糖和乙酸，此為本研究中復合酶系統污泥產VFAs和乙酸量大的主要原因。相比之下，溶菌酶系統中Firmicutes豐度最高，Bacteroidetes豐度較低。相較于空白對照，聯合處理后污泥中Proteobacteria的占比降低，Proteobacteria在厭氧消化過程中會消耗生成的短鏈脂肪酸，其豐度的降低有利于VFAs的累積。

2.5.4 屬水平物種組成

圖6為屬水平物種組成熱圖。相比空白對照，經超聲聯合生物酶處理后的污泥微生物種類和豐度發生了明顯變化，在復合酶系統中，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_11）、普氏菌屬（Prevotella_7）、丙酸螺菌屬（Propionispira）、小桿菌屬（Dialister）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）等水解產酸菌屬豐度顯著提高。其中部分Clostridium_sensu_stricto_11（如丁酸梭菌）可分解碳水化合物產生有機酸，如乙酸、丙酸和丁酸等。Prevotella_7可以淀粉為生長底物，同時也能加速蛋白質的代謝。Dialister可以促進污泥產酸產氣，Propionispira和Acetobacter均可以利用糖類，并將其轉化為乙酸。由此可知，在超聲聯合復合酶的作用下，污泥中產乙酸菌屬占據優勢地位，VFAs和乙酸累積量明顯增加。

相比之下，在溶菌酶系統中，屠場桿狀菌屬（Macellibacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）等豐度顯著提高。Macellibacteroides作為擬桿菌屬的一種，可以利用葡萄糖和其他碳水化合物產生乙酸、正丁酸和異丁酸等。Lactobacillus、Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1均具有較強的代謝碳水化合物和蛋白質的能力，可以促進VFAs的生成。

3、結論

①超聲對污泥性質影響顯著，經超聲處理后，污泥上清液溶出SCOD、TN和TP濃度明顯提高，污泥粒徑減小，比表面積增大，有利于污泥的厭氧發酵水解和產酸過程。

②超聲聯合生物酶促進污泥水解和產酸，其中復合酶的效果最佳，污泥VSS去除率最高可達44.2％，VFAs最大產量為1209.2mg/L，其中乙酸量為736.3mg/L。

③微生物測序結果表明，經超聲聯合復合酶和溶菌酶處理后的污泥微生物豐度和多樣性與空白對照呈現明顯差異。從門水平來看，Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes等水解產酸菌門在復合酶系統污泥中占主導地位；從屬水平上來看，Clostridium_sensu_stricto_11、Propionispira和Acetobacter等水解產酸菌屬豐度相較于空白對照均明顯增加。